抗原的制備方法介紹

實(shí)驗(yàn)步驟一、抗原的提取

抗原的制備是一件十分細(xì)致的工作，要制備一個(gè)高純度的抗原，需要付出艱巨的努力，制備工作涉及物理學(xué)、化學(xué)和生理學(xué)等許多領(lǐng)域的知識(shí)。根據(jù)物理或化學(xué)特性建立起來(lái)的分離、純化方法的主要原理不外乎科二個(gè)方面：①利用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別將他們分配到可用機(jī)械方法分離的兩或幾個(gè)物相中，如鹽析、有機(jī)溶劑抽提、層析和結(jié)晶等；②把混合物置于單一物相中，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用使各組分分配于不同的區(qū)域而達(dá)到分離的目的，如電泳、超速離心和超濾等。由于組織細(xì)胞內(nèi)存著許多分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)不同的抗原物質(zhì)，其分離方法也不一樣，就是同一類(lèi)大分子物質(zhì)，因選材不同，所使用的方法也很大差別。因此很難有一個(gè)通用的標(biāo)準(zhǔn)方法供提取任何生物活性物質(zhì)使用，所以在提取前必須針對(duì)所欲提取的物質(zhì)，充分查閱文獻(xiàn)資料，選用合適的方法。如果要提取一個(gè)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)未知的抗原物質(zhì)，更需要經(jīng)過(guò)各種方法的比較探索，才能找到一些工作規(guī)律和獲得預(yù)期的效果。

抗原物質(zhì)的制備，大概要經(jīng)過(guò)如下過(guò)程：①材料的選擇和預(yù)處理；②細(xì)胞的粉碎（細(xì)胞器的分離）。③提取；④純化；⑤濃縮或干燥，保存?，F(xiàn)分別簡(jiǎn)述如下。

（一）材料的選擇及預(yù)處理

選擇什么材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。通常選含量高、工藝簡(jiǎn)便、成本低的材料。材料選定后，通常要進(jìn)行預(yù)處理，剔除結(jié)締組織、脂肪組織等，把組織塊剪碎。若取材后不立即進(jìn)行提取，則應(yīng)冷凍保存，動(dòng)物組織更要深低溫保存。某些容易失活的物質(zhì)，一般宜采用新鮮材料。

（二）細(xì)胞的粉碎

除了提取體液、組織間液內(nèi)的多肽、蛋白質(zhì)、酶不需粉碎細(xì)胞外，凡要提取組織內(nèi)、細(xì)胞膜上及胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)，都必須把組織和細(xì)胞粉碎，使活性物質(zhì)充分釋放到溶液內(nèi)。不同的組織，細(xì)胞的破碎難易不一，因此所使用的粉碎方法也不*相同。如腦、胰、肝等比較軟嫩的組織，用普通勻漿器研磨就行，肌肉、心臟等則需絞碎后再作勻漿?，F(xiàn)漿常用的細(xì)胞粉碎方法介紹如后。

1．物理法

（1）高速組織搗碎機(jī)：通常由調(diào)速器、支架、馬達(dá)、帶桿刀葉、有機(jī)玻璃筒等組成。把材料放于筒內(nèi)（約占筒內(nèi)容積的1/3）固定筒蓋，開(kāi)動(dòng)馬達(dá)，調(diào)速器由慢逐漸增至所需速度。此法適用于內(nèi)臟組織。

（2）玻璃勻漿器：由一個(gè)內(nèi)壁經(jīng)過(guò)磨砂的玻璃管和一根一端為球狀（球面經(jīng)過(guò)磨砂）玻璃研桿組成。把絞碎的組織置于管內(nèi)，加適量溶液，插入研桿，用手或電動(dòng)轉(zhuǎn)動(dòng)研桿，并上下移動(dòng)。用此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)高，對(duì)大分子的破壞也少。是粉碎少量軟嫩材料（腦、胰、肝等）時(shí)常用的方法。

（3）超聲波處理法：多用于軟嫩組織，根據(jù)不同組織采用不同頻率，處理10～15min，超聲波處理時(shí)溶液溫度升高，使不耐熱的物質(zhì)失活，使用時(shí)為防止溫度升高，除間歇開(kāi)機(jī)外，還需人工降溫，避免溶液內(nèi)存在氣泡。核酸及某些酶對(duì)超聲波很敏感，要慎用。

（4）反復(fù)凍融法：把待碎樣品冷卻到零下15～20。C，凍固后取出，緩慢解凍，如此反復(fù)操作，可使大部分動(dòng)物性細(xì)胞及胞內(nèi)的顆粒破碎，但也可使生物活性物質(zhì)失活。

（5）冷熱交替法：把材料投入90。C左右水中維持?jǐn)?shù)分鐘后取出投入冰浴內(nèi)，可使大部分細(xì)胞破碎?？捎糜谔崛〉鞍踪|(zhì)和核酸。

2．化學(xué)和生物化學(xué)法

（1）自溶法：把新鮮材料置于一定的pH和適宜的溫度下，利用組織細(xì)胞自身的酶系統(tǒng)把組織破壞，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來(lái)。動(dòng)物材料的自溶溫度選在0～4℃，需加少量防腐劑，自溶時(shí)間較長(zhǎng)，不易控制，不常用。

（2）*處理法：多用于破壞大腸桿菌等微生物的細(xì)胞壁。在每毫升含2億個(gè)細(xì)胞的懸液中加100μg至1mg*，37℃，保溫10min，細(xì)胞就破壞了。此外，蝸牛酶、纖維素酶也被選作破碎細(xì)菌細(xì)胞之用。

（3）表面活性劑處理法：較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基吡啶、去氧膽酸鈉等。

（三）抗原的提取

提取、抽提、萃取這3個(gè)詞的含義基本相同。但一般說(shuō)來(lái)，提取是指在分離純化前期，將經(jīng)過(guò)處理或粉碎了的細(xì)胞置于一定條件和溶劑中，讓被提取物充分地釋放出來(lái)的過(guò)程，而抽提則是貫穿于分離純化的整個(gè)過(guò)程中，如在制備核酸過(guò)程中，用反復(fù)提取蛋白液，用*反復(fù)抽提分離DNA和RNA。影響提取的因素主要來(lái)自被提取物在提取的溶劑中的溶解度大小以及它由固相擴(kuò)散到液相的難易。一個(gè)物質(zhì)在某一溶劑中的溶解度大小和該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及使用的溶劑的理化性質(zhì)有關(guān)。一般說(shuō)來(lái)，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性大分子的等電點(diǎn)遠(yuǎn)的pH值使溶解度增加。因此，在不同的抗原提取過(guò)程中，所選用的溶劑的性質(zhì)、pH值、離子強(qiáng)度、抽提溫度、介電常數(shù)等因素是提取成敗的重要因素。要達(dá)到分離提純的目的，必須靈活地應(yīng)用這些因素。