越來越流行的熒光免疫印跡

在化學(xué)發(fā)光印跡中，獲得的信號是可變的，通常被認為是半定量的。然而，在熒光印跡中獲得的信號是與熒光團結(jié)合的抗體復(fù)合物中靶蛋白的豐度成正比的靜態(tài)值。下表列出了化學(xué)發(fā)光和熒光蛋白印跡之間的主要差異。

如上表所示，熒光蛋白印跡法使用用熒光團標(biāo)記的二抗。只有當(dāng)適當(dāng)波長的光激發(fā)時，熒光團才會發(fā)光。因此，熒光印跡在重復(fù)實驗中提供了定量和一致的結(jié)果。然而，可見熒光區(qū)域中相當(dāng)大的膜自發(fā)熒光通常導(dǎo)致較低的信噪比。

此外，通常用于熒光信號檢測的電荷耦合器件（CCD）照相機不能放大弱信號以檢測低表達的蛋白質(zhì)。這兩個問題可能會限制熒光蛋白印跡的使用。

幸運的是，通過使用具有近紅外（IR）染料的雙色檢測系統(tǒng)，克服了熒光蛋白印跡中缺乏敏感性的缺點。由于紅外區(qū)域的背景熒光較低，紅外熒光蛋白質(zhì)印跡比使用可見熒光團的方案提供高達200倍的靈敏度。如下所述，這種增加的靈敏度提供了超過化學(xué)發(fā)光的蛋白質(zhì)印跡的許多重要優(yōu)點。

紅外熒光蛋白印跡的優(yōu)點

1.比化學(xué)發(fā)光更靈敏

紅外熒光印跡已被證明比化學(xué)發(fā)光印跡更敏感. 這是因為IR區(qū)域膜上的低背景熒光產(chǎn)生高的信噪比。配備有光電倍增管（PMT）的激光掃描成像儀對印跡進行成像，并可以將弱信號放大幾個數(shù)量級

2.通過復(fù)用提高量化精度

使用雙色檢測方法可以同時檢測相同印跡上的兩種抗原。例如，您可以分析您感興趣的蛋白，并利用內(nèi)參蛋白（例如GAPDH，肌動蛋白）將其均一化，而無需剝離/重新檢測印跡或運行單獨的凝膠。因此，您的量化將更準確。

3.廣泛的線性動態(tài)范圍用于定量測量

為了確?？煽康亩繙y量，您從western blot獲得的信號必須在線性動態(tài)范圍內(nèi)。這意味著信號強度與目標(biāo)蛋白質(zhì)豐度呈線性相關(guān)。換句話說，信號強度的兩倍增加意味著目標(biāo)蛋白質(zhì)水平增加了兩倍。通過激光成像儀獲得的靜態(tài)熒光值是定量的。這是因為熒光強度與幾個數(shù)量級的蛋白質(zhì)豐度成正比.這提供了廣泛的線性范圍。您可以在相同設(shè)置下量化低豐度和高豐度蛋白質(zhì)，而不用擔(dān)心信號飽和或超出線性范圍。

相比之下，*的動力學(xué)酶 - 底物反應(yīng)和信號飽和將化學(xué)發(fā)光檢測的線性度限制在更小的范圍內(nèi)。您經(jīng)常需要嘗試各種曝光以獲得差異表達蛋白質(zhì)的“正確圖像”。這是為了確保捕獲的信號在線性范圍內(nèi).

4.一致性和可重復(fù)性 

熒光信號是僅取決于目標(biāo)抗原的量的靜態(tài)值，而許多變量影響通過膜曝光獲得的化學(xué)發(fā)光信號。一些變量（例如，酶底物反應(yīng)）難以控制導(dǎo)致不一致和不可重復(fù)的結(jié)果。 Schutz-geschwender等（2004）報道了熒光蛋白印跡實驗重復(fù)的標(biāo)準偏差遠遠小于化學(xué)發(fā)光檢測。因此，為了確保您的免疫印跡結(jié)果的重復(fù)性和準確性。

5.擴展信號持續(xù)時間

熒光信號非常穩(wěn)定。您可以將您的印跡存儲在冰箱中，并在您準備好后再進行成像。相比之下，如果您正在進行化學(xué)發(fā)光的免疫印跡，您通常需要馬上開始成像。這是為了避免酶活性降低。

期刊編輯和評論者越來越普遍要求定量的免疫印跡數(shù)據(jù)。另外，迫切需要提高科學(xué)界的蛋白質(zhì)印跡重現(xiàn)性。正如本文中概述的，IR熒光法相對于化學(xué)發(fā)光的方法有許多優(yōu)點。它不僅可以節(jié)省您的時間，而且還為您提供高品質(zhì)，可發(fā)布和翔實的結(jié)果。還在躊躇猶豫，您不妨從使用如下產(chǎn)品開始，開啟您的熒光免疫印跡之旅！